Tamponi Covid-19, Real-Time PCR e Altre Storie

 

La diffusione del COVID-19 è monitorata utilizzando tamponi per prelevare fluidi respiratori di origine naso-faringea sui quali si testerà la presenza del virus. Il materiale biologico prelevato col tampone viene inviato ad un laboratorio di analisi accreditato, dove viene effettuata l’estrazione dell’RNA e attraverso una tecnica chiamata Reverse Real-Time PCR (rRT-PCR) , rilevata o meno la presenza del virus.

Anche se la rRT-PCR è un test altamente sensibile, la sua affidabilità non è totale. E’ ben noto che questa tecnologia, come del resto tutte le tecnologie molecolari utilizzate in diagnostica, ha la possibilità di falsi positivi e negativi, le cui percentuali dovrebbero essere accuratamente definite in sede di validazione del test. I reagenti fondamentali per eseguire il test rRT-PCR, ovvero i primer oligonucleotidici e la sonda, sono disegnati su regioni conservate del genoma virale SARS-CoV-2, ma i coronavirus mostrano frequenti eventi di mutazione e di ricombinazione.

Come questi eventuali eventi possano influire sulla sensibilità del test, soprattutto con l’andare del tempo, non può essere conosciuto. Inoltre, basse cariche virali in pazienti asintomatici o lievemente sintomatici potrebbero non essere rilevate in modo affidabile mediante rRT-PCR. Riguardo la positività, non si può escludere la presenza di un altro coronavirus umano nel tampone, che potrebbe determinare delle reattività crociate. Ricordiamoci che esistono altri coronavirus umani che possono circolare durante la stagione influenzale assieme ai ‘classici’ virus influenzali.

Nelle settimane successive ai primi casi segnalati, sono state depositate le prime sequenze di genoma SARS-CoV-2 nei database pubblici come GenBank e GISAID. Ciò ha spinto la comunità scientifica internazionale a sviluppare in breve tempo una diagnostica molecolare. I ricercatori dell’Istituto di Virologia di Berlino hanno sviluppato saggi per distinguere l’infezione da SARS-CoV-2 da SARS-CoV in base alla sequenza nucleotidica del gene RNA-dipendente RNA polimerasi (RdRp). Hanno validato la reattività crociata con altri patogeni usando 297 campioni clinici ottenuti da pazienti infetti da patogeni respiratori noti.

Un gruppo separato presso l’Università di Hong Kong ha sviluppato un test quantitativo rRT-PCR per rilevare due diverse regioni del genoma SARS-CoV-2: la regione ORF1b e la regione N del genoma del virus. Il test è stato validato in due pazienti con sospetto COVID-19. Il saggio sulla regione del gene N è risultato essere circa 10 volte più sensibile del saggio su ORF1b, in questi campioni clinici.

I saggi progettati da entrambi i gruppi sono stati condivisi con l’OMS e inviati per l’uso in diversi paesi. Negli Stati Uniti, il CDC ha sviluppato un test qualitativo rRT-PCR per rilevare coronavirus simili alla SARS e identificare in modo specifico SARS-CoV-2. I primer e le sonde sono stati disegnati sulla regione N del virus. In precedenza, i campioni ottenuti da soggetti con sospetto COVID-19 dovevano essere inviati al CDC per il test. Tuttavia, il 4 febbraio 2020, la Food and Drug Administration (FDA) ha rilasciato l’autorizzazione all’uso di emergenza del pannello diagnostico RT-PCR del CDC. Ora, il test può essere spedito ai laboratori di sanità pubblica statali e locali Statunitensi, ai Dipartimento della Difesa e a laboratori internazionali selezionati.

Protocolli, primer e sonde utilizzati dai laboratori italiani, non sono ancora stati chiaramente dichiarati. Non è chiaro se venga fatta una validazione tramite sequenziamento su ogni campione positivo. Il sequenziamento è il “Gold Standard” per validare qualsiasi tipo di test PCR. Procedimento certo più costoso, ma economicamente di scarso rilievo rispetto ai miliardi che sta perdendo in questo momento l’Italia. Attualmente si parla di effettuare test anticorpali, ancora meno sicuri e specifici dell’rRT-PCR. La validazione più sicura di un test in rRT-PCR andrebbe fatta con il sequenziamento del prodotto amplificato, non con un secondo test in rRT-PCR, come molto probabilmente si fa adesso. Il sequenziamento inoltre permetterebbe di seguire la formazione di ogni tipo di mutazione nella regione amplificata.

Concordiamo con il dr. Giannotta che direttive dell’Ordine dei Medici assieme a quelle dell’OMS di fine gennaio 2020, consentono solo la diagnosi tardiva e consentono di identificare esclusivamente i casi gravi. Poiché i principali soggetti coinvolti nella trasmissione dell’infezione del coronavirus sono i soggetti asintomatici e quelli con sintomi di media gravità (circa l’80%), le direttive del Governo e quelle dell’OMS non consentono né la diagnosi precoce, né il contenimento dell’infezione da COVID-19 (si veda: https://www.freedompress.it/covid-19-una-pandemia-in-itinere-dr-giannotta-il-vaccino-i-coronavirus-mutano-per-adattarsi-ai-nuovi-ospiti/ ; https://www.freedompress.it/covid-19-epidemia-dal-nord-italia-giannotta-creare-un-albero-filogenetico-avrebbe-dimostrato-che-non-siamo-gli-untori/; https://www.freedompress.it/infezione-da-covid-19-misure-estreme-ma-poca-analisi-della-clinica-dr-giannotta-diagnosi-sempre-tardive/).

La verificata presenza sul territorio italiano di diverse sequenze genomiche rilevata da ricercatori stranieri e recentemente anche da ricercatori dell’Ospedale Sacco e dell’Università di Milano, rafforza l’ipotesi che l’epidemia nel Nord Italia è probabilmente il risultato di molteplici introduzioni di piccole varianti virali del COVID-19 o che si somma ad altri coronavirus autoctoni, e/o che sono arrivati con i viaggi ed i soggiorni di cittadini stranieri di diversa provenienza, parte dei quali possono aver introdotto, a loro insaputa, delle varianti virali.

Per rispondere adeguatamente ai numerosi dubbi sulla sensibilità e specificità del test effettuato di routine per identificare il COVID-19 in Italia, chiediamo la diffusione di tutte le informazioni tecniche da parte dei laboratori italiani accreditati dall’Istituto Superiore di Sanità, in particolare:

  • Regioni target del genoma SARS-CoV-2 utilizzate per il test
  • Sequenze di primer e sonde
  • Protocolli di amplificazione, strumentazioni e reagenti/kit utilizzati
  • Procedure specifiche utilizzate per validare i campioni positivi, specialmente riguardo l’utilizzo del sequenziamento
  • Controlli positivi e negativi utilizzati

 

A cura di: Loretta Bolgan, Pietro Massimiliano Bianco

9 Risposte

  1. Odoardo Maria Calamai ha detto:

    Articolo ben fatto e ponderato che condivido pienamente

  2. Fabrizio Bergamini ha detto:

    Quindi in caso di tampone positivo non si ha la certezza di avere contratto il covid 19 giusto ? Anche se questo risultato porta ad un crollo emotivo

  3. luca ha detto:

    Nel saggio RT-PCR come mezzo diagnostico Sars-Cov2, si utilizzano primer di sequenze genetiche ben conservate del Cov-2 e necessarie per l espressione Spike. Eventuali mutazioni in questo sito renderebbero una bassa o scarsa affinità virale nel legare il corrispettivo target recettore cellulare. Le sequenze primer (RdRp) queste si sono in effetti rilevate aspecifiche per il Cov-2, e non vengono usate . Pertanto riguardo il problema dei falsi, sono propenso a credere, anche per l’accertata differenza in % , tra falsi negativi e positivi, con percentuale maggiore vs i falsi negativi, che sia più dovuto al problema per una differente gestualità o per modalità o esperienza o incertezza da parte dell’operatore, nel prelevare il campione attraverso gesti meccanici che devono essere intrusivi piuttosto che all’accuratezza del metodo diagnostico.

  4. Ugo Cozzi ha detto:

    Tante parole: manca la cosa più importante. Possibile che si dica tanto ma non si dice quale è la sensibilità e specificità di questo test? Tanto valido ma non vedo i numeri.
    Gradirei sapere questi numeri e la fonte scientifica.,

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